Abstrakt
Celem pracy było zoptymalizowanie metody izolacji całkowitego RNA z bakterii Gram-dodatnich do badań ekspresyjnych. Bakterie Gram-dodatnie ze względu na budowę ściany komórkowej wymagają lizy enzymatycznej. Czas lizy zalecany przez producentów zestawów do izolacji często przekracza 30 min. Uzasadnieniem podjęcia badań było efektywne zniszczenie ściany komórkowej i szybka izolacja niezdegradowanego RNA o niezmienionym stosunku ilościowym transkryptów. Postawiony cel zrealizowano poprzez zastosowanie metody lizy enzymatycznej w czasie 5 minut z większą ilością lizostafiny. Zoptymalizowana metoda izolacji pozwala na obiektywne badania ekspresyjne. Szybkość i efektywność niszczenia ściany komórkowej oraz stabilizacja wyizolowanego RNA o niezaburzonych proporcjach to główne zadanie postawione efektywnej izolacji materiału służącego do badań z wykorzystaniem techniki real-time PCR.
Bibliografia
1. Arciola C. R., Collamat i S., Donati E., Montanaro L.: A rapid PCR method for the detection of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus in periprosthesis infections. Diagn. Mol. Pathol., 10(2), 130, 2001.
2. Chomczynski P., Sacchi N.: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 162(1), 156, 1987.
3. Chomczynski P.: A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques, 15(3), 532, 1993.
4. Conlon K. M., Humphreys H., O’Gara J. P.: Regulation of ica R gene expression in Staphylococcus epidermidis. FEMS Microbiol. Lett., 216, 171, 2002.
5. Edwards K. J., Kaufmann M. E., Saunders N. A.: Rapid and accurate identification of coagulase – negative Staphylococci by real – time PCR. J. Clin. Microbiol., 3047, 2001.
6. Lewin B.: The Messenger RNA Template. In: Genes IV. Ed. by B. Lewin. Oxford : Oxford University Press, 171, 1990.
7. Oh E. T., So J.-S.: A rapid method for RNA preparation from Gram-positive bacteria. J. Microbiol. Methods, 52, 395, 2003.
8. Mangan J. A., Sole K. M., Mitchison D. A., Butcher P. D.: An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res., 25 (3), 675, 1997.
9. Vandecasteele S. J., Peetermans W. E., Merckx R., Eldere J. V.: Quantification of expression of Staphylococcus epidermidis housekeeping genes with Taqman quantitative PCR during in vitro growth under different conditions. J. Bacteriol., 7094, 2001.
10. Wu J. A., Kusuma C., Mond J. J., Kokai-Kun J. F.: Lysostaphin disrupts Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms on artificial surfaces. Antimicrob. Agents Chemother., 47, 3407, 2003.
Praca jest udostępniana na licencji Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 3.0 Unported License.
Prawa autorskie (c) 2009 Autorzy